在完成工程竣工驗收和初期運營前安全評估的基礎上，經南京市政府批準，5號線南段將于2024年3月31日中午12時開通初期運營。屆時，南京地鐵運營里程將由12條線路近460公里增加至13條線路近473公里，車站總數由217座增加至226座。
5號線南段初期運營線路始于吉印大道站，于吉印大道與蘇源大道交叉口處設九龍湖南站，于雙龍大道與誠信大道交叉口東側設誠信大道站，于誠信大道與殷富街交叉口處設前莊站，于科寧路與竹山南路交叉口處設科寧路站，于竹山路與天元東路交叉口處設竹山路站，于竹山路與新亭路交叉口處設新亭路站，于竹山路與上元大街交叉口處設東山站，于土山路與文靖路交叉口南側設文靖路站。
5號線南段初期運營里程為12.9km，設車站9座。其中換乘站3座，分別在吉印大道站與既有S1號線換乘，在誠信大道站與既有3號線換乘，在竹山路站與既有1號線換乘（出站換乘）。全線均采用地下敷設方式。車輛采用A型車，6輛編組，列車最高運行速度為80km/h。
